Reações de Polimerásica em Cadeia – PCR

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PCR - consiste em fazer cópias de DNA “in vitro”, usando os elementos básicos do processo de replicação natural do DNA.

PCR Amplifica uma Seqüência Alvo

Replicação“in vitro” do DNA - Alternância detemperaturas a cada ciclo:
- DESNATURAÇÃO
- ANELAMENTO
- POLIMERIZAÇÃO



Sequência Alvo


• Cada uma das novas fitas de DNA extendidas a partir dos “primers” serve como template para síntese de uma nova fita. Isso garante o aumento exponencial do número de novas fitas.
• Todas as fitas de DNA sintetizadas durante a PCR têm a sequência dos primers na extremidade 5’ e a seqüência complementar aos primers na posição 3’



Cinética da PCR

- Fase de “screening” - ciclos iniciais
Os “primers” procuram o “template” de DNA com as seqüências que lhes são complementares (agem como as sondas nos experimentos de hibridização). Encontrar a seqüência complementar não é tãodifícil, pois os primers estão em considerável excesso em relação ao template.

- Fase intermediária
O processo de amplificação está ocorrendo, levando ao acúmulo exponencial do fragmento de DNA. O pareamento do primer com a sequência que lhe é complementar já está bem facilitada, pois já existem várias cópias das sequências alvo.

- Fase tardia ou fase de platô
A amplificação já é sub-ótima devido à limitação dos reagentes e à competição dos produtos gerados com os primers disponíveis.

Detecção de produtos amplificados
• Eletroforese em gel de agarose após coloração com brometo de etídio
• Eletroforese em gel de poliacrilamida revelado pela prata (PCR + RFLP)
• Hibridização com sondas marcadas fornece um aumento na sensibilidade e especificidade da
amplificação
• PCR + detecção colorimétrica em placas de microtitulação

Ensaio colorimétrico de detecção por hibridização com sondas de captura.

Inibidores da Polimerase
- Fenol
-ProteinaseK
- Agentes quelantes em excesso (EDTA)
- Hemoglobina e outras proteínas das hemácias
- SDS (Sodium Dodecyl Sulphate)
- Elevadas concentrações de sal

Vantagens e Desvantagens da PCR

Técnica rápida e muito sensível; Tamanho de DNA a ser amplificado é limitado; Dada a elevada sensibilidade da técnica, a ocorrência de contaminações pode resultar na presença de falsos positivos; Perigo de inibições; Perigo de ocorrer annealing entre primers.


Diferentes aplicações da técnica da PCR
1. Estudo do padrão de expressão gênica (transcritos raros)
2. Seleção de clones recombinantes, com primers complementares a
seqüências do vetor, em ambos os lados do sítio de clonagem
3. Sequenciamento direto de produtos amplificados
4. Detecção de mutações em genes específicos (diagnóstico precoce
em estudos de câncer e doenças genéticas, estudos terapêuticos para a
determinação do mecanismo de ação de substâncias mutagênicas)
5. Estudos diagnósticos de doenças infecciosas, detecção de
bactérias, vírus e protozoários parasitos
6. Diagnóstico pré-natal em caso de risco
7. Elucidar relações evolutivas entre espécies, utilizando material
arqueológico
8. Grande potencial na Medicina Forense (impressão digital de DNA)

Posted in: Imunologia